donstuAdvanced Engineering Research (Rostov-on-Don)Advanced Engineering Research (Rostov-on-Don)2687-1653Don State Technical University10.23947/2687-1653-2024-24-1-98-108TRWNOMdonstu-2163Research ArticleINFORMATION TECHNOLOGY, COMPUTER SCIENCE AND MANAGEMENTИНФОРМАТИКА, ВЫЧИСЛИТЕЛЬНАЯ ТЕХНИКА И УПРАВЛЕНИЕComputer Program for Primer Design for Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP)Компьютерная программа подбора праймеров для LAMP-амплификацииhttps://orcid.org/0000-0001-6205-8695АхметзяноваЛ. У.AkhmetzianovL. U.

Лиана Ульфатовна Ахметзянова, ассистент кафедры вычислительной техники и инженерной кибернетики

450062, г. Уфа, ул. Космонавтов, 1

Liana U. Akhmetzianova, teaching assistant of the Department of Computer Science and Engineering Cybernetics

1, Kosmonavtov St., Ufa, 450064

www.lianab@mail.ruУфимский государственный нефтяной технический университетРоссияUfa State Petroleum Technological UniversityRussian Federation20242903202424198108Copyright © Akhmetzianov L.U., 20242024Ахметзянова Л.У.Akhmetzianov L.U.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.vestnik-donstu.ru/jour/article/view/2163Introduction

Introduction. To date, numerous methods of nucleic acid amplification have been proposed, and each method has a number of advantages and disadvantages. One of the most popular methods is Loop-mediated isothermal AMPlification (LAMP). Unlike thermocyclic reactions, such as PCR (polymerase chain reaction), which require three temperature changes and expensive equipment, in LAMP, the entire reaction takes place at one and the same temperature and at the maximum rate possible. An important component of LAMP-amplification is primers (usually 20–25 nucleotides), which need to be matched to a specific part of the nucleotide sequence. It is known that DNA sequence contains four nucleotides: A — adenine and T — thymine, G — guanine and C — cytosine. There is a huge variety of permutations of these nucleotides, and it is practically impossible to analyze such a large amount of data manually. Therefore, there is a need to use modern computer technologies. More than 150 computer programs have been proposed for the design of PCR primers, while for LAMP-primers there are less than 10 of them, and each of them has a number of drawbacks, e.g., in terms of the length of the analyzed site. Therefore, this work is aimed at developing a new domestic computer program for the design of specific primers for LAMP.

Materials and Methods

Materials and Methods. The primer search algorithm was based on a linear search for a substring in a string, taking into account the criteria of primer selection for LAMP. The program complex of LAMP-primer design was implemented in Python programming language. The bioPython library was used to work with various DNA and RNA, and the Qt framework was used to develop the interface.

Results

Results. A modification of the direct sampling method using a stencil approach was proposed, taking into account the GC composition and annealing temperature of primers depending on their structure. A software package with a friendly interface was developed. It took into account the design criteria of primers: certificates of registration of computer programs (LAMPrimers iQ No. 2022617417 dated April 20, 2022, LAMPrimers iQ_loop No. 2023662840 dated June 14, 2023) were received. The program is in the public domain at https://github.com/Restily/LAMPrimers-iQ

Discussion and Conclusion. The developed software packages can be used for research and analysis in molecular biology and genetics, to create diagnostic test systems that provide high sensitivity and reliability of detection of specific DNA and RNA. The software packages can be used in research institutes and laboratories engaged in the amplification of nucleic acids. The results of evaluating the selected sets of primers for the LAMP reaction were tested, and the effectiveness of working sets using the LAMPrimers iQ program was experimentally proven by the example of the detection of genetic material of the SARS-CoV-2 coronavirus.

Введение

Введение. На сегодняшний день существует множество способов амплификации нуклеиновых кислот и у каждого способа есть ряд достоинств и недостатков. Одним из наиболее популярных способов является петлевая изотермическая амплификация (Loop-mediated isothermal AMPlification, LAMP). В отличие от термоциклических реакций, таких как ПЦР (полимеразная цепная реакция), для которых требуется смена трех температурных режимов и дорогостоящее оборудование, в LAMP вся реакция проходит при одной температуре и с максимальной на данный момент скоростью. Важным компонентом проведения LAMP-амплификации являются праймеры (обычно 20–25 нуклеотидов), которые необходимо подбирать к определенному участку нуклеотидной последовательности. Известно, что последовательность ДНК содержит четыре нуклеотида: А — аденин и Т — тимин, Г — гуанин и Ц — цитозин. Вариантов перестановок этих нуклеотидов огромное множество, и проанализировать вручную такое большое количество данных практически невозможно, поэтому возникает необходимость в использовании современных компьютерных технологий. Для дизайна ПЦР-праймеров предложено более 150 компьютерных программ, в то время как для LAMP-праймеров их менее 10, и каждая из них имеет ряд недостатков, например, по длине анализируемого участка. Поэтому целью данной работы является разработка новой отечественной компьютерной программы дизайна специфичных праймеров именно для LAMP.

Материалы и методы

Материалы и методы. В основе алгоритма поиска праймеров лежит линейный поиск подстроки в строке с учетом критериев подбора праймеров для LAMP. Программный комплекс дизайна LAMP-праймеров разработан на языке программирования Python. Для работы с различными ДНК и РНК использовалась библиотека bioPython, а для разработки интерфейса — фреймворк Qt.

Результаты исследования

Результаты исследования. Предложена модификация метода прямого перебора с использованием трафаретного подхода, учитывающего GC-состав и температуру отжига праймеров в зависимости от их структуры. Разработан комплекс программ с дружелюбным интерфейсом, учитывающий критерии дизайна праймеров: получены свидетельства о регистрации программ для ЭВМ (LAMPrimers iQ № 2022617417 от 20 апреля 2022 года, LAMPrimers iQ_loop № 2023662840 от 14 июня 2023 года). Программа есть в открытом доступе по адресу: https://github.com/Restily/LAMPrimers-iQ

Обсуждение и заключение

Обсуждение и заключение. Разработанные программные комплексы могут использоваться для исследований и анализа в области молекулярной биологии и генетики, для создания диагностических тест-систем, обеспечивающих высокую чувствительность и достоверность обнаружения специфических ДНК и РНК. Программные комплексы могут применяться в научно-исследовательских институтах и лабораториях, занимающихся амплификацией нуклеиновых кислот. Результаты оценки подобранных наборов праймеров для реакции LAMP апробированы, и эффективность рабочих наборов с помощью программы LAMPrimers iQ доказана экспериментально на примере обнаружения генетического материала коронавируса SARS-CoV-2.

дизайн праймеровпетлевые праймерыpythonС++петлевая изотермическая амплификацияLAMPdesignloop primerspythonС++loop-mediated isothermal amplificationLAMPReferencesГильмиярова Ф.Н., Колотьева Н.А., Гусякова О.А., Сидорова И.Ф. Полимеразная цепная реакция. История открытия. Новый этап развития. Консилиум. Лабораторная диагностика. 2017;154(4):17–21. URL: https://cyberleninka.ru/article/n/polimeraznaya-tsepnaya-reaktsiya-istoriya-otkrytiya-novyy-etap-razvitiya/viewer (дата обращения: 05.11.2023).Gilmiyarova FN, Kolotyeva NA, Gusyakova OA, Sidorova IF. Polymerase Chain Reaction. History of Discovery. New Stage of Development. Konsilium. Laboratornaya diagnostika. 2017;154(4):17–21. URL: https://cyberleninka.ru/article/n/polimeraznaya-tsepnaya-reaktsiya-istoriya-otkrytiya-novyy-etap-razvitiya/viewer (accessed: 05.11.2023). (In Russ.).Гарафутдинов Р.Р., Баймиев А.Х., Малеев Г.В., Алексеев Я.И., Зубов В.В., Чемерис Д.А. и др. Разнообразие праймеров для ПЦР и принципы их подбора. Биомика. 2019;11(1):23–70. URL: https://biomicsj.ru/upload/iblock/ddf/bmcs19111023_1_.pdf?ysclid=lruepfy4zf297918053 (дата обращения: 05.11.2023).Garafutdinov RR, Baymiev AKh, Maleev GV, Alexeyev YaI, Zubov VV, Chemeris DA, et al. Diversity of PCR Primers and Principles of Their Design. Biomics. 2019;11(1):23–70. URL: https://biomicsj.ru/upload/iblock/ddf/bmcs19111023_1_.pdf?ysclid=lruepfy4zf297918053 (accessed: 05.11.2023).Notomi T, Okayama H, Masubuchi H, Yonekawa T, Watanabe K, Amino N, et al. Loop-Mediated Isothermal Amplification of DNA. Nucleic Acids Research. 2000;28(12):e63 https://doi.org/10.1093/nar/28.12.e63Notomi T, Okayama H, Masubuchi H, Yonekawa T, Watanabe K, Amino N, et al. Loop-Mediated Isothermal Amplification of DNA. Nucleic Acids Research. 2000;28(12):e63 https://doi.org/10.1093/nar/28.12.e63Чемерис Д.А., Кирьянова О.Ю., Губайдуллин И.М., Чемерис А.В. Дизайн праймеров для полимеразной цепной реакции (краткий обзор компьютерных программ и баз данных). Биомика. 2016;8(3):215–238. URL: https://biomicsj.ru/upload/iblock/b05/3.pdf (дата обращения: 05.11.2023).Chemeris DA, Kiryanova OYu, Gubaydullin IM, Chemeris AV. Design of Primers for Polymerase Chain Reaction (Brief Review of Software and Databases). Biomics. 2016;8(3):215–238. URL: https://biomicsj.ru/upload/iblock/b05/3.pdf (accessed: 05.11.2023).Ахметзянова Л.У., Давлеткулов Т.М., Гарафутдинов Р.Р., Губайдуллин И.М. Применение алгоритма Ахо-Корасик для подбора праймеров для петлевой изотермической амплификации. Математическая биология и биоинформатика. 2022;17(2):250–265. https://doi.org/10.17537/2022.17.250Akhmetzianova LU, Davletkulov TM, Garafutdinov RR, Gubaydullin IM. Application of the Aho-Korasik Algorithm for the Selection of Primers for Loop Isothermal Amplification. Mathematical Biology and Bioinformatics. 2022;17(2):250–265. https://doi.org/10.17537/2022.17.250Akhmetzianova LU, Davletkulov TM, Sakhabutdinova AR, Chemeris AV, Gubaydullin IM, Garafutdinov RR. LAMPrimers iQ: New Primer Design Software for Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP). Analytical Biochemistry. 2023;684:115376. https://doi.org/10.1016/j.ab.2023.115376Akhmetzianova LU, Davletkulov TM, Sakhabutdinova AR, Chemeris AV, Gubaydullin IM, Garafutdinov RR. LAMPrimers iQ: New Primer Design Software for Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP). Analytical Biochemistry. 2023;684:115376. https://doi.org/10.1016/j.ab.2023.115376Nagamine K, Hase T, Notomi T. Accelerated Reaction by Loop-Mediated Isothermal Amplification Using Loop Primers. Molecular and Cellular Probes. 2002;16(3):223–229. https://doi.org/10.1006/mcpr.2002.0415Nagamine K, Hase T, Notomi T. Accelerated Reaction by Loop-Mediated Isothermal Amplification Using Loop Primers. Molecular and Cellular Probes. 2002;16(3):223–229. https://doi.org/10.1006/mcpr.2002.0415Zhiyong Chen, Yuxue Liao, Xuemei Ke, Jie Zhou, Yixiong Chen, Lulu Gao, et al. Comparison of Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification, Conventional PCR and Real-Time PCR Assays for Japanese Encephalitis Virus. Molecular Biology Reports. 2011;38(6):4063–4070. https://doi.org/10.1007/s11033-010-0525-0Zhiyong Chen, Yuxue Liao, Xuemei Ke, Jie Zhou, Yixiong Chen, Lulu Gao, et al. Comparison of Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification, Conventional PCR and Real-Time PCR Assays for Japanese Encephalitis Virus. Molecular Biology Reports. 2011;38(6):4063–4070. https://doi.org/10.1007/s11033-010-0525-0Nkere CK, Oyekanmi JO, Silva G, Bömer M, Atiri GI, Onyeka J, et al. Chromogenic Detection of Yam Mosaic Virus by Closed-Tube Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification (CT-RT-LAMP). Archives of Virology. 2018;163(4):1057–1061. https://doi.org/10.1007/s00705-018-3706-0Nkere CK, Oyekanmi JO, Silva G, Bömer M, Atiri GI, Onyeka J, et al. Chromogenic Detection of Yam Mosaic Virus by Closed-Tube Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification (CT-RT-LAMP). Archives of Virology. 2018;163(4):1057–1061. https://doi.org/10.1007/s00705-018-3706-0Wang C, Shen X, Lu J, Zhang L. Development of a Reverse Transcription-Loop-Mediated Isothermal Amplification (RT-LAMP) System for Rapid Detection of HDV Genotype 1. Letters in Applied Microbiology. 2013;56(3):229–235. https://doi.org/10.1111/lam.12039Wang C, Shen X, Lu J, Zhang L. Development of a Reverse Transcription-Loop-Mediated Isothermal Amplification (RT-LAMP) System for Rapid Detection of HDV Genotype 1. Letters in Applied Microbiology. 2013;56(3):229–235. https://doi.org/10.1111/lam.12039Hardinge P, Murray JAH. Lack of Specificity Associated with Using Molecular Beacons in Loop Mediated Amplification Assays. BMC Biotechnology. 2019;19(1):55. https://doi.org/10.1186/s12896-019-0549-zHardinge P, Murray JAH. Lack of Specificity Associated with Using Molecular Beacons in Loop Mediated Amplification Assays. BMC Biotechnology. 2019;19(1):55. https://doi.org/10.1186/s12896-019-0549-zБодулев О.Л., Сахаров И.Ю. Изотермические методы амплификации нуклеиновых кислот и их применение в биоанализе. Биохимия. 2020;85(2):174–196. https://doi.org/10.31857/S0320972520020037 Bodulev OL, Sakharov IYu. Isothermal Nucleic Acid Amplification Techniques and Their Use in Bioanalysis. Biochemistry. 2020;85(2):174–196. https://doi.org/10.31857/S0320972520020037Bodulev OL, Sakharov IYu. Isothermal Nucleic Acid Amplification Techniques and Their Use in Bioanalysis. Biochemistry. 2020;85(2):174–196. https://doi.org/10.31857/S0320972520020037Ребольская Ю.А., Васенко Е.А., Мельник С.В., Сабиров Д.Х., Сарыгина Е.В. Бактериофаг лямбда как модельный объект в генетических исследованиях. В: Труды X Международной студенческой научной конференции «Студенческий научный форум-2018». Москва. 2018. URL: https://scienceforum.ru/-2018/article/2018002259 (дата обращения: 09.10.2023).Rebolskaya YuA, Vasenko EA, Melnik SV, Sabirov DKh, Sarygina EV. Bacteriophage Lambda as a Model Object in Genetic Research. In: Proc. X Int. Student Electronic Sci. Conf. “Student Scientific Forum-2018”. Saratov: LLC Nauchno-izdatel'skii tsentr “Akademiya Estestvoznaniya”; 2018. URL: https://scienceforum.ru/2018/article/2018002259 (accessed: 09.10.2023). (In Russ.).

The authors declare that there are no conflicts of interest present.