Введение. Амплификация нуклеиновых кислот является ценным молекулярным инструментом не только в фундаментальных исследованиях, но и в прикладных областях, например таких, как диагностика инфекционных заболеваний, наследственных патологий, установление родства и т. д. В настоящее время методы амплификации интенсивно развиваются, расширяются и области их применения. Самым популярным и наиболее часто используемым методом амплификации является полимеразная цепная реакция (ПЦР) [1]. ПЦР — это реакция, проходящая при трех различных температурных режимах: денатурация (95 °С), отжиг праймеров (от 50° до 60 °С), элонгация (72 °С). Для быстрой смены этих режимов необходим специальный прибор — ДНК-термоциклер [2]. При этом смены температурных режимов в амплификаторе происходят не моментально, а начинаются лишь по достижении нужной температуры, и это ведет к искусственному сдерживанию протекания реакции. Как правило, продолжительность ПЦР составляет 1–1,5 часа.

Вторым по популярности методом амплификации является петлевaя изотермическaя aмплификaция (Loop AMPlification, LАMP) [3]. Для проведения LAMP достаточно водяной бани или термостата, так как реакция проходит при одной температуре, и первые результаты можно увидеть уже через 15 минут.

Как для LAMP, так и для любого другого вида амплификации ключевым компонентом являются праймеры, которые представляют собой короткую последовательность нуклеиновой кислоты и служат отправной точкой для увеличения копий определенного участка ДНК. Именно праймеры определяют, какая последовательность ДНК будет копироваться.

Основным отличием проведения LAMP является количество праймеров. Для обычной LAMP необходимо минимум четыре праймера (два внешних, два внутренних), в то время как для обычной ПЦР достаточно двух (прямой, обратный).

Для повышения специфичности и точности реакции важно правильно подобрать праймеры. Для автоматического подбора праймеров для ПЦР разработано более 150 различных компьютерных программ, которые позволяют подбирать праймеры для любых модификаций этой реакции [4]. Однако для LAMP таких программ крайне мало, не более десяти, и всего две из них доступны онлайн. Также эти программы имеют ряд недостатков, таких как ограничения по длине анализируемой последовательности, не исключают возможности образования гомо- и гетеродимеров праймеров, повторов нуклеотидов в одном праймере. И ни одна программа не учитывает сближенное расположение праймеров в одном наборе, что, в свою очередь, снижает качество праймеров и точность результатов реакции [5].

Вследствие этого актуальной задачей является разработка новой компьютерной программы, позволяющей подбирать (моделировать) качественные наборы праймеров для LAMP-амплификации с ужесточенными условиями подбора праймеров для нуклеотидных последовательностей любой длины.

Материалы и методы. Авторы оригинальной статьи [3] предложили использовать два внешних, F3 (Forward), B3 (Backward), и два внутренних праймера, FIP (Forward Inner Primer), BIP (Backward Inner Primer). Предполагалось, что внутренние праймеры имеют удвоенную длину (FIP: F1c/F2, BIP: B1c/B2) и отжигаются на четырех участках нуклеотидной последовательности. Схематично расположение LAMP-праймеров можно увидеть на рис. 1.

Внешние праймеры необходимы только на начальном этапе. Они предназначены для того, чтобы ограничить анализируемый участок нуклеотидной последовательности и образовать одноцепочечную структуру этого участка. Пара внутренних праймеров, F1c и B1c, начинают свою работу уже на втором этапе, поскольку они отжигаются после образования новых цепей ДНК.

Позже теми же авторами был предложен модифицированный метод, предлагающий использование не четырех, а шести праймеров, отжигающихся уже на восьми участках целевой нуклеотидной последовательности [7]. Предлагалось добавить еще два петлевых праймера (Loop B, Loop F), которые должны вступить в реакцию на третьем этапе после образования гантелеобразной структуры ДНК и отжигаться между участками F1/F2 и B1/B2 соответственно. Использование дополнительных праймеров подразумевает увеличение чувствительности и достоверности реакции.

Любая реакция амплификации имеет свой порог чувствительности, и разброс данного показателя весьма велик ввиду того, что на протекание как ПЦР, так и LAMP влияет множество факторов. В некоторых работах отмечается, что LAMP по чувствительности значительно превосходит ПЦР. Например, авторы работы [8] утверждают, что LAMP чувствительнее ПЦР в 10 раз. Авторы других работ выявили, что LAMP чувствительнее ПЦР в 100 раз [9], а у некоторых этот показатель достигает 1 000 раз [10].

Помимо чувствительности, у любой реакции амплификации есть еще один не менее важный показатель — ее специфичность. И здесь к LAMP-амплификации в последнее время стали появляться вопросы [11], в том числе из-за возникновения так называемых праймерных гомо- и гетеродимеров, исключить которые в этой реакции сложнее, чем в ПЦР, ввиду большего числа используемых праймеров и их увеличенной длины [12].

Для успешного проведения амплификации необходимо правильно подобрать праймеры. При использовании метода LAMP основная сложность заключается в моделировании праймеров c учетом всех рекомендуемых условий, а именно:

В таблице 1 приведены краткие характеристики и возможности наиболее популярных программ дизайна LAMP-праймеров [5].

Дизайн праймеров для LAMP-амплификации представляет собой весьма трудную задачу и требует разработки специальной компьютерной программы с должным функционалом, учетом всех рекомендуемых условий и с возможностью расширенного подбора праймеров и удобным интерфейсом.

Компьютерная программа дизайна праймеров разработана на языке программирования Python. Данный язык имеет библиотеку bioPython, которая позволяет работать с нуклеотидными последовательностями, а также фреймворк Qt для разработки интерфейса.

Результаты исследования. С учетом особенности строения нуклеотидных последовательностей и критериев подбора LAMP-праймеров была предложена модификация метода прямого перебора с использованием трафаретного подхода, учитывающего GC-состав, температуру отжига праймеров и позволяющего снизить сложность перебора.

Как известно, GC-состав праймеров должен быть в пределах от 40 до 60 %. Это один из важных критериев подбора LAMP-праймеров, который зависит от самой анализируемой последовательности, длины праймера и частично влияет на температуру отжига (Тm, °С).

В данной работе для расчета температуры отжига праймеров используется формула:

(1)

где [Na+] — молярная концентрация ионов натрия; (%G + %C) — GC-состав в анализируемой последовательности, выражается в процентах; L — длина праймера. За ее основу была взята известная зависимость:

(2)1

Формула (1) была подобрана эмпирически, расчетные значения сопоставлялись со значениями, получаемыми с помощью удобной утилиты OligoAnalyzer2, которая предоставляет качественный подбор праймеров для любых видов амплификации нуклеотидных кислот. Определив длину праймеров, GC-состав и температуру отжига, можно найти все возможные праймеры в нуклеотидной последовательности любой длины, которые будут удовлетворять заданным критериям.

Если представить праймер как подстроку, а анализируемую нуклеотидную последовательность как более длинную строку, данную задачу можно представить как перебор всех возможных вариантов (прямой поиск), но усложнив его за счет расчета GC-состава и температуры отжига праймеров.

На рис. 2 представлена полная блок-схема работы алгоритма прямого перебора, учитывающая:

Общая сложность модифицированного алгоритма в худшем случае: O(m×n), где n — длина праймера; m — длина нуклеотидной последовательности. Необходимо понимать, что время работы алгоритма напрямую зависит от того, насколько часто встречаются удовлетворяющие требованиям нуклеотидные фрагменты.

В таблице 2 приведены данные поиска всех возможных праймеров в нуклеотидных последовательностях различной структуры по времени.

Далее из всех найденных праймеров необходимо сформировать наборы, учитывая сближенное расстояние между праймерами, гетеродимерность в одном наборе, а также минимальную разницу температур отжига праймеров.

Схема дизайна формирования праймеров в наборы для LAMP представлена на рис. 3.

На входе программа считывает нуклеотидную последовательность, либо загружается нужный файл, либо вставляется фрагмент через буфер обмена. Далее устанавливаются конфигурации, такие как длина праймеров, GC-состав, температура отжига праймеров и разница температур в одном наборе. Затем происходит поиск всех возможных праймеров, удовлетворяющих установленным конфигурациям, подобранные праймеры сортируются в наборы и выводятся на экран пользователю.

Работа компьютерной программы:

В случае соблюдения всех вышеперечисленных условий набор считается рабочим.

Программа для LAMP-амплификации зарегистрирована в Реестре программ для ЭВМ под названием LAMPrimers iQ, № 2022617417 20 апреля 2022 года и LAMPrimers iQ-loop, № 2023662840 14 июня 2023 года. Код программы в открытом доступе3.

Разработанный программный продукт обладает дружественным и интуитивно понятным интерфейсом, что позволяет использовать его непосредственно конечным пользователям — экспериментаторам, занимающимся LAMP-амплификацией.

Обсуждение и заключение. Количество выданных наборов праймеров зависит от заданных параметров поиска. Чем строже параметры, тем меньше наборов будет найдено. В случае жестких ограничений программа может не выдать ни одного набора. Количество наборов праймеров при различных параметрах подбора для генома бактериофага лямбда [13], длина которого составляет ~48 500 нуклеотидов, представлено в таблице 3.

Для относительно коротких нуклеотидных последовательностей (до 2 000 нуклеотидов) подбор праймеров занимает менее секунды. С увеличением длины последовательности длительность поиска праймеров увеличивается экспоненциально.

На рис. 4 представлено влияние длины нуклеотидной последовательности на длительность подбора наборов праймеров. Приведены данные для нуклеотидной последовательности бактериофага лямбда на ноутбуке с параметрами: процессор Intel(R) Core(TM) i7-10750H CPU, 2.60GHz, 6 ядер. 16 ГБ ОЗУ. Указаны параметры мягкого подбора праймеров (40–60 % GC, ΔTm = 5, длина анализируемого участка — до 300 п. н.).

Следует отметить, что продолжительность поиска праймеров зависит от мощности компьютера.

Для сравнения и определения качества смоделированных наборов праймеров был проведен ряд натурных экспериментов по обнаружению РНК коронавируса SARS-CoV-2, длина которого ~ 30 000 нуклеотидов. Для этого к одному и тому же участку нуклеотидной последовательности коронавируса были подобраны наборы LAMP-праймеров с помощью программы LAMPrimers iQ и двух популярных и доступных онлайн-утилитов от компании New England Biolabs (NEB LAMP)4 и PrimerExplorer5. Обозначения L, N и P соответствуют наборам праймеров LAMPrimers iQ, NEB LAMP Primer Design и PrimerExplorer; «+» — образцы содержали РНК коронавируса SARS-CoV-2, «–» — образцы не содержали нуклеиновых кислот. На рис. 5 приведены кривые данного эксперимента.

Праймеры, полученные с помощью PrimerExplorer, показали самый поздний подъем кривых амплификации (P+), по сравнению с NEB LAMP (N+) и LAMPrimers iQ (L+). Праймеры, полученные с помощью LAMPrimers iQ, обеспечивали более поздний подъем кривых амплификации (L+) по сравнению с (N+). Однако образцы, не содержащие РНК вируса (P–), выдали более поздний подъем по сравнению с набором (N–), в то время как (L–) не показали никаких подъёмов даже после 50 минут, тем самым обеспечивая самую высокую надежность обнаружения вирусной РНК.

Проведенные эксперименты показали более высокую точность и специфичность наборов праймеров, подобранных с помощью компьютерной программы LAMPrimers iQ, вызванную снижением скорости протекания реакции с образцами отрицательного контроля. Кривые амплификации имели более поздние подъемы или не имели их вообще, даже по истечении 50 минут продолжительности реакции.

1. Oligo Calc: Oligonucleotide Properties Calculator. URL: http://biotools.nubic.northwestern.edu/OligoCalc.html (дата обращения: 10.12.2023).2. OligoAnalyzer™ Tool. URL: https://eu.idtdna.com/pages/tools/oligoanalyzer?returnurl=%2Fcalc%2Fanalyzer (дата обращения: 10.12.2023).3. LAMPrimers-IQ. URL: https://github.com/Restily/LAMPrimers-iQ/blob/main/lamp/start_lamp.py (дата обращения: 10.12.2023).4. NEB LAMP Primer Design Tool. URL: https://lamp.neb.com/#!/ (дата обращения: 24.11.2023).5. LAMP primer designing software Primer Explorer. URL: http://primerexplorer.jp/e (дата обращения: 25.11.2023).