Введение. Регенеративной медицине постоянно требуются материалы, которые способствуют ускорению регенерации костной ткани [1]. Даже с появлением новых решений проблема сохраняет актуальность, т. к. переломы — очень распространенный вид травм [2]. Отметим, что пациенты полностью восстанавливаются лишь в 16 % случаев. По данным Всемирной организации здравоохранения, в мире фиксируется порядка 50 млн тяжелых травм, которые приводят к потере трудоспособности и инвалидности. Поэтому лечение дефектов костных тканей — актуальная медицинская и социальная проблема [3]. Чтобы помочь пациенту, используют трехмерные биополимерные матрицы на основе скаффолдов. Они содержат элементы, близкие по структуре к соединительной костной ткани. Один из таких материалов для регенеративной медицины — наноразмерные формы карбоната магния [4]. Магний — это эссенциальный микроэлемент [5]. Он отвечает за крепость костей [6] и участвует в их формировании [7]. На его основе создаются ортопедические имплантаты [8]. В наноразмерной форме карбонат магния обладает такими свойствами, как:

В биологических взаимодействиях важную роль играют шероховатость и химический состав поверхности элементов [10]. Будущие материалы на основе соединений в нанометровом диапазоне могут в конечном итоге изменить природу тканей вокруг имплантата и повысить клиническую успешность такого подхода [11]. Для улучшения названных выше свойств применяют биополимеры. Один из них — хитозан [12]. Это важный биосовместимый компонент соединительной ткани. Он хорошо растворяется и разлагается [13].

Основная цель данного исследования — создание метода синтеза стабилизированного хитозаном наноразмерного карбоната магния, а также исследование его свойств. Материал рассматривается как основа скаффолд-матриксов для регенеративной медицины.

Материалы и методы. Методом химического осаждения наночастицы карбоната магния синтезировали из магнийсодержащего прекурсора — ацетата магния. Осадителем был карбонат аммония, стабилизатором — полисахарид хитозан. На первом этапе в раствор ацетата магния добавляли необходимый объем 1 % раствора хитозана. Далее с помощью капельной воронки при постоянном перемешивании в раствор прекурсора вводили раствор осадителя со скоростью 60 капель в минуту. После введения всего раствора осадителя полученный золь перемешивали еще 10 минут. Синтезированный золь прокрутили в центрифуге, а затем высушили в сушильном шкафу. Так получили образцы порошка карбоната магния. Их фазовый состав исследовали с помощью метода порошковой дифрактометрии на приборе Empyrean (производитель PANalytical, Нидерланды) при следующих параметрах измерений:

Микроструктуру образцов карбоната магния исследовали с помощью сканирующего электронного микроскопа MIRA3-LMH (Tescan, Чехия).

Для подготовки проб двухсторонний проводящий углеродный скотч помещали на приборный столик (12 мм), наносили порошок исследуемого материала и углеродный слой толщиной 10 нм. Параметры измерения:

Для компьютерного квантово-химического моделирования карбоната магния при взаимодействии с хитозаном использовали программное обеспечение QChem. Для исследования выбрали метод Хартри — Фока и базисный набор 6–31G1. Для конфигурации молекул задействовали молекулярный редактор IQmol [14]. Образцы исследовали методом инфракрасной (ИК) спектроскопии. С этой целью применили ИК-спектрометр с Фурье-преобразованием. Модель ФСМ 1201 (Россия).

Порошки MgCO3 и KBr тщательно смешивали в соотношении 1:300 и прессовали в виде таблетки в специальной пресс-форме под давлением 500–1 000 МПа. Полученные образцы помещали в спектрометр и проводили измерения в пределах — 400–4 400 см–1.

Методом динамического рассеяния света на приборе Photocor complex (Россия) исследовали средний гидродинамический радиус наночастиц карбоната магния, стабилизированных хитозаном. Их ζ-потенциал оценивали с помощью метода акустической и электроакустической спектроскопии на спектрометре DT–1202 (Dispersion Technology Inc., США).

Метод получения наночастиц карбоната магния оптимизировали с помощью многофакторного эксперимента. Для этого использовали параметры:

Данные обработали с помощью программы Statistica 10.0. Уровни варьирования представлены в таблице 1.

Далее строили матрицу планирования эксперимента (таблица 2).

Результаты исследования. На первом этапе изучили фазовый состав полученных образцов. Результаты представлены на рис. 1.

Далее при помощи сканирующего электронного микроскопа (СЭМ) исследовали микроструктуру полученных образцов наночастиц карбоната магния, стабилизированных хитозаном (рис. 2).

Для исследования способа координирования наночастиц карбоната магния с хитозаном проводили квантово-химическое моделирование молекулярных структур карбоната магния с хитозаном. Результаты показаны в таблице 3 и на рис. 3, 4. Здесь HOMO — высшая заселенная молекулярная орбиталь, LUMO — низшая свободная молекулярная орбиталь.

Для подтверждения данных квантово-химического моделирования образцы исследовались методом инфракрасной спектроскопии. Результаты представлены на рис. 5.

Для изучения влияния входных параметров на синтез наноразмерного карбоната магния формировали тернарные зависимости. На рис. 6 представлена зависимость среднего гидродинамического радиуса наночастиц от содержания исходных реагентов.

Анализ фазового состава образцов показал, что присутствуют фазы карбоната магния безводного (MgCO3), две конфигурации карбоната магния в виде кристаллогидрата (MgCO3 · 5H2O), Mg2(CO3)(OH)2 · 3H2O и оксида магния (MgO).

При анализе микроструктуры поверхности наночастиц карбоната магния установлено, что образец обладает анизотропной формой. Карбонат магния представлен стержнеобразными частицами длиной от 2 до 10 мкм, которые состоят из наночастиц размером от 30 до 60 нм.

Компьютерное квантово-химическое моделирование позволило сравнить энергию при взаимодействии с основным карбонатом магния:

В первом случае значение энергии будет ниже, чем во втором. Это указывает на химическую и энергетическую выгоду образования таких комплексов (для карбоната магния энергия взаимодействия более 462,00 ккал/моль, а для основного карбоната — более 736,00 ккал/моль).

В оптимальном варианте координирования карбоната магния с хитозаном взаимодействие происходит через гидроксильную группу хитозана, присоединенную к C6 остатку глюкозамина. Данное взаимодействие имеет самую низкую энергию ∆E = 462,387 ккал/моль и химическую жесткость η = 0,062 эВ.

Положение функциональных групп определяли по ИК-спектроскопии наночастиц карбоната магния, стабилизированных хитозаном. Дополнительно фиксировали спектры чистого хитозана и карбоната магния. Анализ ИК-спектра карбоната магния показал, что в области от 2 200 до 3 000 см–1 находятся валентные колебания групп NH3+, NH2+, NH+ и CH2, –CH3. Полосы на 988 см–1, 1 102 см–1, 1 414 см–1 и 1 529 см–1 связаны с колебаниями C–O и C=O в группе CO32 [16]. Полоса на 620 см–1 соответствует колебаниям гидроксильной группы, а полосы на 698 и 852 см–1 обусловлены колебаниями связи Mg–O [17]. Анализ ИК-спектров хитозана показал, что область от 2 500 до 3 400 см–1 отвечает за валентные колебания следующих функциональных групп: –OH, –CH3, CH2 [18]. Область от 1 000 до 1900 см–1 характеризует колебания связей C–O, C–O–C, –CH2, –CH3, C–N, NH2+ [19]. Область полос от 500 до 900 см–1 относится к деформационным колебаниям: на 898 см–1 — связи C–H [20], на 581, 652, 704 и 768 см–1 — связей –CH и –CH2. Как показал анализ образца наночастиц карбоната магния, стабилизированных хитозаном, в диапазоне от 2100 до 3000 см–1 находятся валентные колебания групп NH3+, NH2+, NH+, –CH3, CH2, O–H. Это характерно для молекулы хитозана. Также присутствуют полосы на 1414 см–1 и 1529 см–1, которые соответствуют колебаниям C–O и C=O в группе CO32, что подтверждает наличие функциональных групп карбоната магния в системе [21]. Связывание магния подтверждается наличием деформационных колебаний C–O и C=O в группе CO32– и колебаний связи Mg–O и CO32– в диапазоне от 700 до 1 100 см–1 [22]. Отмечается уменьшение интенсивности пиков на 620 см–1 и 1 078 см–1, которые соответствуют колебаниям O–H и C–O групп. Это указывает на взаимодействие карбоната магния и хитозана через гидроксильные группы и согласуется с результатами квантово-химического моделирования. Изучение полученных тернарных поверхностей приводит к выводу, что изменение соотношения между ацетатом магния и карбонатом аммония заметно влияет на размер и дзета-потенциал частиц карбоната магния. Средний гидродинамический радиус частиц не зависит от содержания хитозана. Однако изменение дзета-потенциала связано с содержанием стабилизатора и концентрацией осадителя, что важно для оценки стабильности наноразмерных систем. В результате были выбраны параметры исходных реагентов, при которых образец наночастиц карбоната магния обладает оптимальными радиусом и дзета-потенциалом:

Обсуждение и заключение. Магний в составе карбоната магния необходим для нормального функционирования организма. В процессах обмена он обеспечивает эффективное усвоение макронутриентов. Это позволяет говорить об актуальности и потенциальной востребованности метода получения наноразмерного карбоната магния, стабилизированного хитозаном. Данный подход разработан и оптимизирован в рамках представленной научной работы. Установлено, что наночастицы карбоната магния представляют собой агломераты стержнеобразной формы длиной от 2 до 10 мкм. Эти скопления состоят из наночастиц размером от 30 до 60 нм. Оптимальный способ координирования молекул — взаимодействие карбоната магния через гидроксильную группу в C6 остатке глюкозамина в молекуле хитозана. Преимущество обеспечивается значительными показателями энергии и химической жесткости.

ИК-спектроскопия образцов наночастиц карбоната магния, стабилизированных хитозаном, выявила падение интенсивности полос, которые характеризуют колебания O–H группы (для карбоната магния) и колебания группы C–O (для хитозана). Из этого следует, что взаимодействие происходит через гидроксильные группы хитозана.

Выполненная в рамках представленной работы оптимизация метода синтеза наночастиц карбоната магния, стабилизированных хитозаном, позволяет сделать ряд утверждений.

1. Здесь 6–31G — базисный набор, который использовался в данном исследовании. STO-nG — это семейство базисных наборов орбиталей слейтеровского типа.