GATCGGenerator: новый генератор для создания квазислучайных нуклеотидных последовательностей

Введение. ДНК является уникальным биополимером, обеспечивающим хранение, передачу и воспроизведение генетической информации в живых организмах. Молекулы ДНК состоят из четырех типов нуклеотидов, содержащих азотистые основания аденин (A), гуанин (G), цитозин (C), тимин (T). Их возможные комбинации обеспечивают нуклеотидные последовательности, формирующие функциональные генетические элементы. В молекулярной биологии и генетике основные работы ведутся с нуклеотидными последовательностями живых организмов, однако возрастает потребность в создании искусственных последовательностей, особенно при решении небиологических задач (например, ДНК-вычисления [1][2], хранение в ДНК [3], криптография [4], ДНК-метчики в гидрологии [5] и др.).

Нуклеотидные последовательности легко оцифровываются путем присвоения соответствующих двоичных кодов отдельным нуклеотидам [7–11] или блокам нуклеотидов [12–14], поэтому текстовые, графические или мультимедийные файлы можно преобразовывать в последовательности нуклеотидов [15–18]. Искусственные нуклеотидные последовательности можно составить вручную или сгенерировать с помощью специального программного обеспечения (генераторы ДНК) в зависимости от решаемых задач. Некоторые генераторы ДНК разрабатывались как самостоятельные приложения, другие — как часть программных пакетов, предназначенных для решения общих [19] ^{1, 2, 3, 4, 5} или специфических задач [20]. Как правило, генераторы ДНК разработаны на основе комбинаторных подходов и производят случайные последовательности заданной длины гуанин-цитозинового (GC) состава. Однако такие программные решения не учитывают химические свойства нуклеотидов и не позволяют получать последовательности с определенной структурой (например, без гомополимерных участков или длинных повторяющихся мотивов). Поэтому создаваемые такими генераторами последовательности не всегда можно воспроизвести в лабораторных условиях. Кроме того, такие последовательности могут быть идентичны существующим в природе фрагментам ДНК, что вносит неоднозначность при попытках закодировать информацию небиологического характера.

Цель представленной работы — создание генератора нуклеотидных последовательностей особой структуры, которые можно применять при кодировании текстовой, графической и другой информации в молекулах ДНК.

Материалы и методы. Определены критерии, которые следует иметь в виду при создании последовательностей. Учтена необходимость варьировать GC-состав, задавать определенное количество динуклеотидов, исключить гомополимерные участки в последовательностях.

Коллектив авторов разработал программу GATCGGenerator на языке Python 3.6 (Anaconda distribution)⁶. Для создания бота⁷ в «Телеграм» (Telegram) использовали Numpy 1.19 [21] и библиотеку Python GATCGGenerator. Решение предоставляется как SaaS (от англ. software as a service — программное обеспечение как услуга), что открывает возможность доступа с разных устройств и платформ.

Входные параметры: количество последовательностей, их длина, GC-состав и содержание динуклеотидов. Генератор исключает повторы длиной от двух нуклеотидов более четырех раз. Результат представлен в виде файла CSV, который содержит следующую информацию: последовательность, GC-состав и количество всех нуклеотидов.

Повторы и гомополимерные фрагменты хранятся в виде отдельного списка. Сначала случайным образом генерируется последовательность из четырех элементов (random.choice(nuc), где nuc = 'ACGT'). Затем выполняется поиск повторов. Если встречается хотя бы один элемент из списка, выполняется новая случайная генерация. Далее рассчитывается GC- и NN-состав. Если NN-состав не соответствует заданному пользователем диапазону, парный нуклеотид заменяется случайным образом и пересчитывается GC-состав. Если последовательность соответствует входным параметрам, она записывается во множество последовательностей (sequences).

Требования к сгенерированным нуклеотидным последовательностям задаются с помощью чата в Telegram. Пример взаимодействия с пользователем показан на рис. 1.

В рамках представленной работы сравнивались функциональные возможности генераторов случайных последовательностей и GATCGGenerator. Определялись различия входных параметров и получаемых в результате работы программы конкретных нуклеотидных структур (таблица 1).

GATCGGenerator обладает более широким функционалом, дает возможность пользователю указывать количество динуклеотидов, создавать последовательности без протяженных гомополимерных участков и повторов, влияющих на успешность эксперимента. В существующих генераторах возможно только варьирование GC-состава.

Программа, созданная авторами данной научной работы, генерирует заданное количество квазислучайных последовательностей нуклеотидов, не имеющих гомологии с природной ДНК, но пригодных для молекулярно-биологических манипуляций.

Результаты исследования. GATCGGenerator позволяет генерировать специфические последовательности ДНК или РНК длиной от 20 до 5 000 нуклеотидов, содержащие заданное количество динуклеотидов и не содержащие гомополимерных участков (не более двух одинаковых нуклеотидов, расположенных рядом). Более жесткие условия генерации могут привести к длительному подбору последовательностей. В качестве примера приведем небольшой диапазон возможного содержания гуанина и цитозина и динуклеотидов (допустим, GC-состав 45–50 % и NN-состав 10–20 %). Продолжительность работы программы для различных входных данных представлена в таблице 2.

GATCGGenerator благодаря более жестким условиям генерации последовательностей снимает ограничения известных генераторов ДНК и создает квазислучайные последовательности нуклеотидов в зависимости от заданных входных параметров. Можно указать необходимое количество последовательностей, их длину,
GC-состав и содержание динуклеотидов, а также природу нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК). Например, созданные с помощью GATCGGenerator последовательности могут быть использованы в ДНК-стеганографии, применяемой для защиты и передачи информации путем сокрытия содержания сообщения в последовательности нуклеотидов [3].

Предлагаемое программное решение (GATCGGenerator) позволяет получать набор квазислучайных последовательностей нуклеотидов в зависимости от заданных пользователем входных параметров (тип нуклеиновой кислоты, длина последовательности, GC- и динуклеотидный состав). GATCGGenerator исключает наличие любых нуклеотидных повторов и гомополимерных участков длиннее трех элементов. Сгенерированные последовательности могут быть использованы как служебные или маскирующие (например, в ДНК-стеганографии) и подходят для любых небиологических ферментативных манипуляций. Можно сгенерировать множество искусственных нуклеотидных последовательностей и использовать их для создания универсальной олиготеки, пригодной для многократного кодирования небиологических данных и их длительного хранения.

Данные, представленные в таблице 3, обобщенно демонстрируют результаты работы программы. Для определенного типа нуклеиновой кислоты (в данном случае ДНК) показаны: содержание динуклеотидов (NN %), количество сгенерированных последовательностей, их длина (нуклеотиды — нт) и GC-состав.

Полученные 30-нуклеотидные последовательности проверили с помощью инструмента Blast от NCBI. Выявлено отсутствие 100-процентной гомологии с известными ДНК-последовательностями живых организмов. Максимальное совпадение наблюдалось для сгенерированных последовательностей длиной 25 нуклеотидов (сходство около 80 %). Это свидетельствует о способности GATCGGenerator с высокой эффективностью генерировать небиологические нуклеотидные последовательности. Можно считать, что сгенерированные таким образом последовательности не имеют абсолютного совпадения с нуклеотидными фрагментами живых организмов.

В этом случае в качестве удобного носителя информации можно задействовать специальные ДНК-олигонуклеотиды искусственного происхождения, содержащие информативную и служебную части. Недавно авторы данной работы предложили использовать NYRN-олигонуклеотиды [14], состоящие из:

• внутренней части (YR)n, кодирующей зашифрованную информацию;
• служебных (вспомогательных) частей S1 и S2, фланкирующих последовательность (YR)n (рис. 2).

Длина участков (n, k и m) может варьироваться, но структура служебных частей должна обеспечивать успешное протекание реакций амплификации (длина более 18 нт, 40–60 % GC-состав, отсутствие гомополимерных участков и повторов). GATCGGenerator позволяет включать динуклеотиды NN, содержащие одинаковые парные нуклеотиды (например, AA, GG, CC, TT или UU для РНК), которые могут повысить специфичность молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот.

Обсуждение и заключение. Итак, по итогам выполненной научной работы предложено программное решение (GATCGGenerator), которое в сравнении с традиционными подходами предполагает более жесткие условия генерации последовательностей. Благодаря этой его особенности снимаются ограничения известных генераторов ДНК и формируются квазислучайные последовательности нуклеотидов в зависимости от заданных входных параметров. Исследованы полученные 30-нуклеотидные последовательности. Проверка позволила установить отсутствие 100-процентной гомологии с известными ДНК-последовательностями живых организмов. Максимально (примерно на 80 %) совпали сгенерированные последовательности длиной 25 нуклеотидов.

Отметим также, что для сокрытия информации в NYRN-олигонуклеотидах, необходимо их смешать с маскирующей ДНК. Маскирующие последовательности должны быть аналогичны последовательностям NYRN-олигонуклеотидов, чтобы при попытке считывания скрытой информации невозможно было их распознать без ключевых последовательностей. Адресату должны быть известны ключевые последовательности — праймеры к служебным участкам NYRN-олигонуклеотидов. Адресат может расшифровать переданное сообщение путем выделения информативных последовательностей нуклеотидов с помощью полимеразной цепной реакции с последующим секвенированием. Набор NYRN- и маскирующих олигонуклеотидов можно легко получить с помощью GATCGGenerator, синтезировать, а затем сохранить в виде олиготеки. Для этого достаточно определить оптимальные NYRN-олигонуклеотиды с последующим заполнением олиготеки. В дальнейшем планируется проведение лабораторных экспериментов с целью апробации предложенного метода хранения небиологической информации и проверки жизнеспособности олиготек, получаемых с помощью генератора.